A ( تهیه بافر های مورد نیاز آزمون الیزا:‌

ابتدا بافرهاي لازم جهت الايزا تهیه شدند. چون مواد مورذ نیاز طبق پروتکل براي 1 ليتر در نظر گرفته شده است، در اين آزمايش مقدار مواد بر حسب مقدار بافر مورد نیاز استفاده شده است :‌

1-    بافر (1x) PH = 7.4  (Phosphat salin Buffer) PBS

         ml 500                                         ml 1000

Nacl                                             8 gr                                         4gr

KH₂PO₄                                    2/0 gr                                       1/0gr

Na₂HPO₄                                 15/1 gr                                    57/0 gr

KCl                                          2/0 gr                                      1/0 gr

 براي تهيه اين بافر، مواد با مقدار فوق  وزن گرديد و در داخل يك بشر ريخته و مقداري آب مقطر به آن اضافه شد. براي حل شدن كامل مواد در آب، ‌يك مگنت در بشر گذاشته و بشر روي دستگاه استرير قرار داده شد تا مواد كاملاً در آب حل شود. سپس pH آن با دستگاه pH-meter  اندازه گيري شد. چنانچه PH محلول مورد نظر بالاتر بود با افزودن HCl و در صورت پایین بودن با NaOH میزان pH تنظيم می شود.

بعد از تنظيم PH با آب حجم محلول به cc 500 رسيد. از اين cc 500 بافر cc 50 آن جهت تهيه بافر Conjugate و cc 50 براي تهيه بافر عصاره گيري (Extraction Buffer) ‌و cc 400 باقيمانده  براي تهيه بافر شستشو (Washing Buffer) استفاده گرديد.

2-    بافر شستشو Washing Buffer PH = 7.4  (PBS –T)

                              ml 400                        ml 1000  

                              0.5 ml                        200 μl                  Tween 20

 براي تهيه اين بافر مقدار گفته شده از  Tween 20 در همان مقدار از بافر PBS كه در بالا گفته شده حل شد. ابتدا بايد pH بافر روی 7.4 تنظیم شده و سپس حجم بافر با افزودن آب به cc 400 رسید.

3-    بافر عصاره گيري (Extraction Buffer) PH = 7.4

تركيبات زير با نمك هاي مورد نياز جهت تهيه بافر PBS ادغام شد. و پس از تنظيم pH محلول همانند مراحل قبل كل حجم محلول به cc 50 رسيد.

                             cc 50                            ml 1000

                             gr 1                             gr 20                        PVP MW 24000

                             μl 200                         ml 5/0                     Tween 20

4-    بافر پوشش دهنده PH = 9.6  (Coating Buffer)

                          cc 50                     ml 1000 

                         gr 07/0                  gr 59/1                      Na₂Co₃

                        gr 15/0                  gr  93/2                  NaHCo₃  

                        gr 2%                    gr   2/0                         NaN₃   

 همانند مراحل  قبل  مواد گفته شده وزن شد و پس از تنظيم PH به حجم cc 50 رسيد.

5-    بافر تركيب پادتن – آنزيم (Conjugate Buffer)   PH = 7.4

                            cc 50                  ml 1000

                           gr 1                   gr  20                PVP MW 24000  

                         μl 20                     ml 5/0                  Tween 20

                         gr  1/0                  gr 2                      egg albumine 0.2%    

نمك هاي بالا به بافر PBS اضافه شد و پس از همزدن و تنظيم pH حجم آنها به cc 50 رسيد.

6-    بافر سوبسترا  PH = 9.8  (Substrate Buffer) 

                             ml 20                    ml 1000

                            ml 944/1                   ml 97              diethanolamine

تنظيم براي اسيديته از طريق اسيد هيدروكلريك (HCL) صورت مي پذيرد.