1) پوشش دادن كف چاهك هاي اليزا با IgG :
براي اينكه كف چاهك را با IgG پوشش دهيم نياز است ابتدا IgG را رقيق كنيم براي اينكار از بافر كربنات (Coating Buffer) استفاده شد.
IgG به نسبت 500 / 1 رقيق شد يعني μl 10 از IgG را به cc 10 بافر كربنات اضافه كرديم و كاملاً بهم زديم. بعد از اين كار مقدار μl 100 از IgG محلول در بافر پوششي را به هر چاهك اضافه كرده و بعد از اينكه تمام چاهك ها پر شد روي پليت با يك پارافيلم پوشانيده شد. پوشانيدن پليت با پارافيلم براي اين است كه IgG تبخير نشود. سپس پليت اليزا در يخچال كه دماي آن C ˚ 4 سانتيگراد بود به مدت يك شب ماند اين كار به منظور اتصال بهتر IgG به كف چاهك انجام شد.
4) شستشوی چاهک ها با بافر شستشو:
بعد از اينكه IgG در چاهك ها به مدت يك شبانه روز ماند پليت اليزا را از يخچال خارج كرده و با سمپلر IgG اضافي را از چاهك ها خارج كرده و در داخل ظرفي كه مخصوص آنتي بادي است برگردانده شد. در اين مرحله باید دقت شود تا نوك سمپلر به كف چاهك ها برخورد نكند. (در صورت برخورد، IgG متصل شده به كف چاهك كنده شده و همراه با بقيه IgG هاي اضافی خارج مي شود)
چاهك ها را 3 بار و هر بار به مدت 5 دقيقه با بافر شستشو مي شوييم. براي اين كار بافر را با فشار كم وارد چاهك ها كرده تا IgG كف چاهك كنده نشود.
2) تهيه عصاره گياهی و افزودن آنتي ژن به چاهك ها :
براي تهيه عصاره گياه، برگهايي را که قبلاً به آنها مشكوك هستيم و حاوي ويروس مورد نظر است را به قطعات ريز تكه تكه كرده و رگبرگ اصلي همراه با ساقه ها و دمبرگ ها جدا شده و فقط از پهنك برگ استفاده شد. سپس قطعات برگ درون هاون چيني ريخته شده و بافر عصاره گيري به نسبت 1 گرم از بافت برگ به cc1 بافر اضافه گرديد و با دسته هاون برگها كاملاً خرد شده بطوريكه عصاره سبز گياه كاملاً خارج شد. سپس عصاره مخلوط با بافر استخراج در داخل تيوپ هايي كه قبلاً شماره گذاري شده بود ريخته شد. لازم به ذكر است كه كليه مراحل استخراج عصاره در هاون برروي یخ انجام شد و تيوپ هاي اپندورف بعد از پر كردن با عصاره در داخل يخ قرار داده شدند تا فعاليت آنزيم ها به حداقل كاهش يابد.
سپس μl 95 از هر عصاره داخل تيوپ را كشيده و به درون چاك ها ریخته شد. لازم است قبل از اين كار نقشه پليتي را كه مي خواهيم عصاره درون آن ريخته شود بكشيم و محل هر نمونه مشخص شود. به درون چاهک های حاشیه ای عصاره نمونه ریخته نمی شود و به جای آن با آب مقطر پر می شوند. علت اينكه فقط در چاهك هاي حاشيه اي آب مقطر ریخته می شود، جلوگيري و حذف اثر زمينه اي (Back ground) است.
به غير از نمونه هاي مورد بررسي 2 چاهك را با عصاره نمونه سالم (شاهد منفي) و 2 چاهك با عصاره آلوده (شاهد مثبت) و دو چاهك نيز فقط با بافر عصاره گيري به عنوان بلانك پر گرديد.
مجدداً روي پليت با پارافيلم پوشانيده شده و جهت Over night به مدت 1 شب در يخچال در دماي ˚c4 قرار داده شد.
5) شستشوی چاهک ها با بافر شستشو:
پس از ریختن عصاره گیاهی از درون چاهک های پلیت، چاهك ها را مانند مرحله قبل 3 بار و هر بار به مدت 5 دقيقه با بافر شستشو مي شوييم. براي اين كار بافر را با فشار كم وارد چاهك ها كرده تا IgG كف چاهك كنده نشود.
6) افزودن آنتي بادي متصل شده به آنزيم (IgG_Conjugate)
IgG Conjugate همان IgG است كه در ستون كروماتوگرافي خالص شده و با گلوتار آلدئيد به آنزيم آلكالين فسفاتاز متصل شده است. بعد از اينكه عصاره ها را از داخل چاهك ها خارج كرديم 3 بار شستشو انجام داده شد. وبعد IgG Conjugate به چاهك ها اضافه شد. قبل از اضافه كردن IgG Conjugate آنرا به نسبت 500 / 1 رقيق کردیم. براي رقيق كردن مقدار μl 2 از IgG Conjugate به cc 1 بافر Conjugate باید اضافه شود و مقدار μl 90 از اين ترکیب را به هر چاهک اضافه می شود. پس از پر كردن همه چاهك های درونی (چاهک های حاشیه ای با آب مقطر پر می شوند) سطح پليت با پارافيلم پوشانيده شد و در داخل انكوباتور به مدت 4 ساعت در دماي 37 درجه سانتيگراد قرار گرفت.
6- اضافه کردن سوبسترا :
بعد از 4 ساعت پليت اليزا را از انكوباتور خارج كرده و با سمپلر IgG Conjugate اضافي از چاهك ها كشيده و به ظرف مخصوص آن برگردانيده شد. سپس همانند مراحل قبل چاهك ها را شستشو داده و در مرحله بعد سوبسترا به چاهك ها اضافه گرديد. براي اضافه كردن سوبسترا لازم است تا قرص آنرا در بافر سوبسترايي كه تهيه كرده ايم حل كنيم (سوبسترا را كه بصورت قرص پارانيترو فنيل فسفات است بايد به نسبت mg / ml 1 در بافر سوبسترا حل كنيم).
بنابراين μl 9600 = μl 100 × 96
مقدار مورد نياز سوبسترا براي كل پليت 96 خانه اي → ml 6/9 = μl 9600 → μl 1000 = cc 1
يعني در مجموع 6/9 ميلي لیتر از تركيب فوق را نياز داريم تا به 96 خانه اضافه كنيم چون نسبت قرص mg 1 در ml 1 از بافر است پس 9 ميلي گرم آنرا در cc 10 بافر بايد حل كنيم.
پس از تهيه تركيب سوبسترا در محلول بافر سوبسترا به ميزانμl 87 از بافر را كشيده و به چاهك اضافه مي كنيم. و به منظور جلوگیري از تاثير نور برروي سوبسترا پليت را در محل تاريكي قرار می دهیم. اگر حداكثر تا 2 ساعت پس افزودن محلول سوبسترا واکنش رنگ زایی در چاهك ها مشاهده نشد بايد پليت را درون يخچال با درجه 4 به مدت 24 ساعت قرار دهيم. پس از واکنش رنگ زایی می توان به منظور توقف واكنش رنگ زايي به هر چاهك مقدار 10 ميكرو ليتر از محلول سود 3 مولار اضافه كنيم.
در نهايت نتايج را يادداشت مي كنيم و نتايج را با نقشه اي كه قبلاً كشيده ايم مورد بررسي قرار مي دهيم.
نوسازی تغذیه و حفاظت از گیاهان زراعی با فناوری زیستی، ساری، ایران